今天给同学们分享一篇生信文章“Identification of hub genes and pathways in lung metastatic colorectal cancer”，这篇文章发表在BMC Cancer期刊上，影响因子为3.8。
结果解读：
原发性和肺转移性CRC组织之间的差异表达基因的鉴定
使用在线软件GEO2R分别分析GSE68468和GSE41258的概要，筛选原发性结直肠癌样本和肺转移性结直肠癌样本之间的差异表达基因（DEGs）。使用|log(Fold change)|> 1和调整后的P值< 0.05作为截断标准，筛选出GSE68468和GSE41258中的DEGs，并在图1A-D中显示。此外，还确定了57个交集上调的DEGs（GSE68468中的185个和GSE41258中的94个）和18个交集下调的基因（GSE68468中的99个和GSE41258中的38个）（图1E，F）。
功能富集分析
GO类别富集分析使用DAVID软件进行，并在图2A-C中显示了前五个显著术语。原发性和肺转移性结直肠癌患者之间的差异表达基因(DEGs)主要涉及炎症反应、细胞黏附、趋化性、ERK1和ERK2级联的正调节以及免疫反应的生物过程(BP)。对于细胞组分(CC)，发现DEGs富集在细胞表面、细胞外基质(ECM)、细胞外囊泡、细胞外空间和细胞外区域的形成中。此外，分子功能(MF)包括ECM结构成分、铁离子结合、趋化因子活性、免疫球蛋白受体结合和抗原结合。
Hub基因鉴定，蛋白质相互作用（PPI）网络构建和模块分析
STRING数据库被用于构建PPI网络。将原发性和肺转移性CRC患者之间的DEGs上传到STRING网站，以分析这些蛋白质的相互作用关系。根据连接度最高的原则，使用Cytoscape中的cytoHubba插件确定了前10个关键基因，其中包括8个上调基因（CLU，SFTPD，SFTPB，SFTPC，CCL18，SPP1，APOE和BGN）和2个下调基因（MMP3和CXCL5）（图3A，B）。此外，通过Cytoscape中的Molecular Complex Detection（MCODE）插件进行了模块分析，图3C，E显示了前两个显著模块。GO功能、KEGG通路和Reactome基因集的分析表明，这两个模块主要涉及ERK1/2级联的正调控、多细胞有机体过程、细胞外基质组织、表面活性物质代谢以及病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（图3D，F）。
在GEO数据库中验证原发性和转移性结直肠癌之间的关键基因表达
为了评估上述生物信息学分析的结果，作者进一步检查了其他GEO数据集中关键基因的转录水平。与GSE68468和GSE41258的结果一致，CLU、SFTPD、CCL18、SPP1、APOE和BGN的mRNA水平明显增加（图4A、B和E-H），而MMP3和CXCL5在转移性CRC中明显降低与原发性CRC相比（图4I、J）。然而，在原发性和转移性CRC之间，SFTPC和SFTPB的转录水平没有显著差异（图4C、D）。因此，在接下来的研究中，作者主要关注8个关键基因（CLU、SFTPD、CCL18、SPP1、APOE、BGN、MMP3和CXCL5），而不包括SFTPC和SFTPB。
CRC中的关键基因的预测分析
为了探索关键基因的预后价值，作者分析了TCGA和GEO数据库中的CRC患者，并发现CLU、SFTPD、CCL18、SPP1、APOE和BGN的mRNA水平在晚期CRC阶段上调（图5A-F），而MMP3的表达在CRC阶段下调（图5G）。此外，CXCL5的表达水平在不同的CRC阶段没有显著变化（图5H））。此外，对CRC患者的8个关键基因进行Kaplan-Meier生存分析。结果显示，CLU、SFTPD、CCL18、SPP1、APOE和BGN的高表达与CRC患者的整体生存率较差呈正相关（图5I-N））。然而，MMP3的高表达与较长的整体生存率相关（图5O）。此外，与不同CRC阶段的表达状态类似，CXCL5的转录水平与整体生存率没有显著相关（图5P））。
在原发性结直肠癌和肺转移性结直肠癌中验证关键基因的蛋白质水平
由于图5中的数据表明CXCL5的表达在CRC患者中没有显著的预后价值，作者主要关注其他7个关键的关键基因（CLU，SFTPD，CCL18，SPP1，APOE，BGN和MMP3）。为了进一步验证这些关键的7个关键基因在CRC肺转移进展中的蛋白水平，作者通过先前报道的体内选择方法建立了高度肺转移的MC38-Luc细胞亚系（命名为MC38-Luc-LM）[19]（图6A）。接下来，作者检查了MC38-Luc-LM是否具有高度肺转移能力。将原始的MC38-Luc细胞和肺转移的MC38-Luc-LM细胞经静脉注射到C57/BL6小鼠体内，然后进行每周生物发光成像（BLI）检测。在细胞接种后的第0天，两组之间的BLI信号没有明显差异（图6B）。两周后，与原始的MC38-Luc细胞相比，MC38-Luc-LM细胞在肺转移能力上显著增强，这表现为肺区域中升高的荧光素强度、更大的肺部大小和增加的肺转移结节数量（图6B-D）。此外，在实验结束时没有发现肝转移。
SFTPD对结直肠癌的恶性表型有贡献
为了进一步确认上述生物信息学分析的准确性和可靠性，作者选择了SFTPD作为三个关键基因（CLU、SFTPD和CCL18）之一，它不仅在肺转移性结直肠癌中得到特别增强，而且与结直肠癌患者的不良预后显著相关。作者构建了稳定过表达SFTPD的MC38-Luc细胞（图7A），发现与表达载体的细胞相比，SFTPD的过表达显著增强了细胞增殖和克隆能力（图7B-C）。此外，通过划痕愈合实验和Transwell实验，作者发现SFTPD在MC38-Luc细胞中的过表达显著增加了细胞迁移和侵袭能力（图7D-F）。
总结
总之，作者的生物信息学分析确定了与肺转移性CRC相关的DEG和hub基因，它们可能在调节CRC肺转移中发挥关键作用。共确定了75个DEG和10个hub基因，富集分析表明表面活性剂代谢可能在CRC肺转移中起主导作用。CLU、SFTPD、CCL18、SPP1、APOE、BGN和MMP3等7个核心枢纽基因与CRC的晚期和不良预后显著相关。重要的是，CLU、SFTPD和CCL18可能与CRC的特异性肺向性转移呈正相关，并作为预防和治疗CRC肺转移患者的潜在靶点。值得注意的是，作者的研究表明，SFTPD对驱动CRC肺转移至关重要。这些发现可能有助于深入了解CRC肺转移。需要进一步的研究来验证这些发现的结果。
