学习笔记Day17：转录组上游分析-1

转录组上游分析-1

作业：

取出fastq文件中的所有序列ID（第一行）

less SRR1039510_1.fastq.gz | awk '{if(NR%4==1){print $0}}'

less SRR1039510_1.fastq.gz | paste - - - - | cut -f 1

取出fastq文件中的所有序列（第二行）同上
对序列出现次数进行统计
```
 less SRR1039510_1.fastq.gz | paste - - - - | cut -f 2 | sort | uniq -c | sort -nk 1
```
如果某一序列出现次数非常高，考虑可能是核糖体RNA？或实验过程中的异常情况，可以比对序列来查看该序列来源

数据质控

数据质量评估

FastQC软件：可以对fastq格式的原始数据进行质量统计。
- 官方网站—帮助文档
- 常用参数：
- 任务运行
  1. 在当前窗口直接运行
  2. 将命令后台运行nohup ... &
  3. 将命令写入sh脚本，使用nohup ... &运行脚本
- 绝对路径运行脚本
```
multiqc=/home/t_rna/miniconda3/envs/rna/bin/multiqc
fastqc=/home/t_rna/miniconda3/envs/rna/bin/fastqc
fq_dir=$HOME/project/Human-16-Asthma-Trans/data/rawdata
outdir=$HOME/project/Human-16-Asthma-Trans/data/rawdata

# 使用绝对路径运行
$fastqc -t 6 -o $outdir ${fq_dir}/SRR*.fastq.gz >${fq_dir}/qc.log
```
- 确定后台任务结束
  1. 看结果目录有无正常结果生成
  2. htop中是否有命令正在运行
  3. ps fx看本人的进程
  4. 读输出的运行日志
- 质控后生成的html文件即质控报告
  
  数据量统计方式：生物学中碱基数量VS计算机中的存储字节（需要加以区分）
  - per base sequence quality
    
    按位置展示碱基质量的箱线图
  - per sequence quality scores
    
    横坐标：一条序列碱基的平均Q值（一条序列中N越多，质量值越低）
    
    纵坐标：每个质量值对应的read数
    
    较好结果：
  - per base sequence content
    
    每个碱基位置上：ATGC含量的分布图
    
    理论上G/C、A/T的含量在测序循环上应分别相等，且稳定呈水平线。
    
    差数据：出现分离。
  - per sequence GC content
    
    GC含量分布图，蓝色和红色线分别为理论值和实际值，越接近越好；一般呈单峰分布。
  - Atapt
    
    公司提供数据
- 整合FastQC结果
  
  multiQC *zip

数据过滤

原始序列质量控制标准：

去除含接头的reads；
过滤去除低质量值数据，确保数据质量；
去除含有N（无法确定碱基信息）的比例大于5%（可以自定义）的reads。

过滤接头

trim_galore

在这里插入图片描述

单个样本的运行

trim_galore -q 20 --length 20 --max_n 3 --stringency 3 --fastqc --paired -o ./ ../../rawdata/SRR1039510_1.fastq.gz ../../rawdata/SRR1039510_2.fastq.gz

多个样本的运行

先获得样本名组成的文件ID

while循环

# 多个样本 vim trim_galore.sh，以下为sh的内容
rawdata=$HOME/project/Human-16-Asthma-Trans/data/rawdata
cleandata=$HOME/project/Human-16-Asthma-Trans/data/cleandata/trim_galore
cat ID | while read id
do
  trim_galore -q 20 --length 20 --max_n 3 --stringency 3 --fastqc --paired -o ${cleandata} ${rawdata}/${id}_1.fastq.gz ${rawdata}/${id}_2.fastq.gz
done