锌指结构与C2H2型锌指蛋白

参考维基百科：https://zh.wikipedia.org/wiki/%E9%94%8C%E6%8C%87

所谓C2H2型号，即指motif中重复单元具有C2H2模式，

Cys2His2的配位化学

整体结构如上，2个β-sheet，1个α-helix，形成的ββα折叠结构，

其中两个Cys半膀氨酸在β-sheet侧，两个His组氨酸在α-helic侧。

Cys2His2的配位原子

为了了解这个四配位的具体成键几何情况，我们需要查看一下这两个氨基酸的结构，主要关注点是和Zn离子形成配位的原子：

• 首先是Cys

所以我们一般在结构文献以及文件中都会看到类似SG的标注，其实说明的就是gamma位的S原子（也就是巯基S原子，Sy）

• 其次是His

因为侧链上有含N杂环，也就是咪唑环，所以命名规则上会稍微复杂一点；

从现有的资料来看，我们可以直接记忆规则，

从理解上，可以参考我下面的论述，仅代表个人观点，

⚠️ 总而言之，前面的图示符号是官方的命名，下面的如何理解这个符号命名是个人的观点

⚠️ 注意我在IUPAC还是PDB上都暂时没有找到数字1、2的命名来源，

有的说是第1个N、第2个N，就是按照如果选定了1个方向，然后在骨架上遇到的N和C分别是第1个还是第2个的N还是C；

也有的说是按照咪唑环上选定了1个方向之后（N首选的那个方向作为第1个方向），

当然从结果上来说，其实第1个方向遇到的连续的N/C必然是N1、C1，两种说法其实在结果上契合的；

所以，⚠️ 下面的说法仅代表个人观点，作为简单记忆口诀

具体IUPAC对于His的命名规范，可以参考：https://iupac.qmul.ac.uk/AminoAcid/AA1n2.html

所以我们一般会在结构文件中看到ND1/NE2这样的写法，

首先计算机上只能显示字母，我们实际当然用的希腊字母来音译，

D就是delta，E就是epsilon，

所以这个字母和原子我们能够理解，然后无非是1、2这样的编号，

总之，从结果上来说：1.可以说是N首选那个方向是1号分支，然后遇到的N就是N1；2号分支遇到的那个N就是N2（当然，需要都止步于epsilon层）2.也可以说N首选的那个方向为准，然后遇到的第1个N是N1，第2个N是N2（然后N内部按照顺序有delta-epsilon） 其实法2更容易理解一点，也符合情理

那么这个时候就有一个问题了，C2H2形成的配位键中，到底His是哪一个N原子参与形成配位键呢？是ND1还是NE2？

这个问题还得查阅文献为参考，

⚠️ 以下表述仅为我查阅文献的个人观点，只能说基本上（一般情况下）我们通常都只考虑NE2，但是生物并没有绝对的事

对于PDB结构文件中对于氨基酸的原子命名规则，可以参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/1895834657817343215

一些细节可以参考文献：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/9781119951438.eibc0484?saml_referrer，或者是springer press出版社中的book

His的质子化

这个是分子动力学模拟里不得不品的一环

以下讨论资料，参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/1893338643923435649

讨论His的质子化位点，基本上都是围绕着这两个N原子来：

也就是ND1/NE2 这两个N原子的质子化情况（也就是多一个氢）

• His是统称，具体质子化情况依据3种情况，可以将His再进一步分类

分子动力学模拟中的His质子化

这里有一篇文献可以参考：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4498602/

假设该结构中的所有组氨酸的质子化状态未知。有的结构，比如NMR解析的结构将氢原子也解析了出来，这样的结构组氨酸的质子化状态可能已确定，只需要通过修改PDB文件中名称进行建模即可。

因为大部分晶体解出来的结构都不会带有氢原子，基本上都是重原子（也就是非氢原子），所以基本上很难知道到底His的质子化情况如何，也就是氢原子加在哪里。

我们都知道gromacs中第一步pdb2gmx中有一个参数 --ignh，其实就是忽略原始结构中的氢原子（因为怕加错），统一由程序来自动加氢。

具体来说，反映到结构文件上，对His的加氢，也就是质子化的分析，

本质上就是将His的residue name改成对应的质子化name

所以操作上，加氢的关键就是修改His的残基name

比如说我这里手头上有1个pdb结构文件，就是1个C2H2型的锌指蛋白结构，

其中原始结构文件有His组氨酸，

然后在第1步pdb2gmx之后的topol文件（蛋白chain的topol文件），

我们能够看到在拓扑文件中，所有的HIS组氨酸都进行了自动质子化处理，

有的组氨酸被定为HSD，有的HSE，有的HSP。其中HSE占大多数，HSP最少见

当然，一般算法评估的质子化状态是不准确的，有时候经验（比如说理论知识先验、文献先验、实验先验）等确定了某些特殊的his质子化状态，这个时候就需要我们手动人工矫正了。

其实就是带上参数 -his 然后人工每一个组氨酸自己手动矫正

当然，我们前面也说过，判断his质子化状态，在结果上本质就是修改pdb结构文件中的his name

电荷可以直接改，质子化要加一个正电荷，去质子化要加一个负电荷

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=50067&highlight=zn

Cys的质子化

先分清3个关键残基缩写：CYS / CYM / CYS2

1. CYS：中性半胱氨酸，侧链巯基 $ \boldsymbol{-SH} $，质子化状态
2. CYM：去质子化半胱氨酸，巯基解离为 $ \boldsymbol{-S^-} $，带负电硫负离子
3. CYS2：一般指二硫键交联的两个半胱氨酸（Cys-S-S-Cys），是氧化产物

C2H2锌指中为什么配位Zn²⁺必须用CYM而不是CYS

我们可以在gromacs中模拟类似配位金属的帖子中参考相关经验，

参考：https://gromacs.bioexcel.eu/t/protein-unfold-completely-after-md-simulation-in-charmm36-force-field/8317/5

http://bbs.keinsci.com/thread-28602-1-1.html?u_atoken=6a48e2a2-5d7e-135d-7d81-55a5f1fe2105&u_asig=2f7b12a817831615062085529e

首先his的质子化状态可以由pdb2gmx自动处理

也可以参考文献：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biochem.9b01055

直接的结论

1. Zn²⁺是二价路易斯酸，驱动巯基去质子化

Zn²⁺带+2正电荷，属于强路易斯酸；半胱氨酸巯基S有孤对电子，是路易斯碱。
配位时：

$ \ce{Cys-SH + Zn^2+ -> Cys-S^- -> Zn^2+ + H+} $

巯基 $ \ce{-SH} $ 失去质子变成硫负离子 $ \ce{S^-} $ 才能与Zn²⁺形成稳定配位键；
此时残基不再是中性CYS（-SH），而是阴离子态CYM（$ \boldsymbol{\ce{S^-}} $）。

2. 关键区分：CYM去质子化 ≠ CYS2二硫键氧化

• CYM（配位巯负离子）：仅去质子化（电离），S的氧化态不变，依然是-2价；没有形成S-S共价键，只是单S⁻结合金属。
• CYS2（二硫键）：两个巯基发生氧化反应：$ \ce{2 -SH -> -S-S- + 2H+ + 2e-} $，S被氧化，生成共价二硫桥，不结合Zn²⁺。

锌指C2H2模式里：两个半胱氨酸都以CYM（$ \ce{S^-} $）配位Zn。

His、Cys质子化总结

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=22814&highlight=%C8%A5%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=18733&highlight=%C8%A5%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=15858&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=54459&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=51288&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=46516&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=45729&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=40334&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=37467&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=36534&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=35921&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

其他的一些用于预测蛋白质质子化状态的工具

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=33210&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=29310&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF&u_atoken=6a491032-6beb-131e-764c-192ce6b89e14&u_asig=2f7b12a517831731708291930e

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=27784&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=21092&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=25828&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

参考：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=7625&highlight=%D6%CA%D7%D3%BB%AF

本质上的逻辑是：pdb2pqr、H++、Propka3等pka计算程序计算蛋白质或配体的Pka（或者是到zinc数据库中查询小分子在生理条件下水溶液中的质子化状态），然后和要模拟的溶液环境ph进行比较：

如果是使用gromacs的pdb2gmx，–ignh会自动判断质子化状态，比如说设置前面的His的NE2，

如果有与预期不合理的地方，比如说Cys的Cym去质子化状态，需要自己-inter手动设置特定残基的质子化状态
pdb2pqr

金属离子Zn的建模

前面处理的质子化，结果就是：

HIS清楚和Zn配位时质子化在什么地方，一般是HSD；

CYS清楚和Zn配位时一般去质子化，改成CYM；

可以自己修改原始pdb文件，或者是在pdb2gmx之后修改gro和top文件

此处对于金属离子Zn2+，有两种方式建模，

• 当做是游离金属离子：http://bbs.keinsci.com/forum.php?mod=viewthread&tid=23232&highlight=zn

具体可以整个复合物进pdb2gmx，或者是先移除金属离子做pdb2gmx再补回来

• 当做是成键原子（比如说这里的配位键），简单点就是自己添加一个谐振势，自己约束一下atom和bond；

正规一点就是用Amber的MCPB工具（金属中心配位工具），当然也有ZAFF