单细胞测序已经成为解析肿瘤微环境的重要技术，它能把组织中的免疫细胞、肿瘤相关细胞和不同转录状态拆解出来，让研究者看到“有哪些细胞”和“它们在转录层面有什么差异”。但单细胞测序在组织解离后完成，天然会丢失细胞原本所在的位置。对于肿瘤免疫微环境研究而言，细胞是否进入肿瘤核心、是否停留在侵袭边缘、是否靠近特定巨噬细胞或肿瘤细胞，往往和单纯的细胞比例一样重要。因此，当单细胞测序已经给出候选细胞群和marker后，下一步并不一定必须先做空间转录组；如果研究问题已经指向蛋白标志物、功能状态和组织原位邻域，PCF可以直接承接单细胞测序结果。

近期，《Cell》发表的“Tumor-associated macrophages trigger MAIT cell dysfunction at the HCC invasive margin”文献，正好提供了一个优秀的方法学参考。研究者首先利用scRNA-seq分析肝细胞癌(HCC)患者肿瘤和邻近肝组织中的CD45+免疫细胞，识别出髓系细胞、T细胞、B细胞、NK细胞以及一个明确的MAIT细胞群。进一步对MAIT细胞进行亚群分析后，文献观察到不同MAIT细胞亚群在细胞毒性分子、炎症因子和功能异常相关基因上的差异。例如，一些亚群保留较强的细胞毒性相关转录特征，而另一些亚群则呈现PDCD1、CTLA4、ICOS等功能异常相关特征。这一步解决的是“细胞图谱”和“转录状态”的问题。

但仅有单细胞测序还不够回答一个更具体的问题：这些MAIT细胞在组织中到底在哪里？它们是在肿瘤核心内，还是停留在邻近肝组织和侵袭边缘？它们表达的关键免疫检查点蛋白是否能在组织原位观察到？它们靠近哪些细胞？文献使用37-plexPCF(CODEX)空间蛋白成像，将MAIT细胞、TAM、Treg、CD8 T细胞、NK细胞等放回完整组织结构中观察，并把组织分为邻近肝组织、侵袭边缘和肿瘤核心。对于PCF而言，这正对应了它的核心价值：把单细胞测序提示的候选细胞群和marker转化为抗体Panel，在同一张切片中观察蛋白表达、细胞状态和空间位置。

从课题设计角度看，单细胞测序之后直接做PCF，适合那些已经有明确细胞群和关键marker的问题。例如，单细胞测序发现某类TAM亚群后，可以用PCF观察其是否富集在肿瘤边缘、是否表达PD-L1、CD163等蛋白，并进一步分析它与T细胞或MAIT细胞的邻近关系；单细胞测序发现T细胞功能异常状态后，可以用PCF观察PD-1、TIM-3、GZMB、Ki67等蛋白层状态是否与特定组织区域相关。这样做不是否定空间转录组，而是在研究问题已经聚焦蛋白和组织原位功能状态时，选择更直接的蛋白层观察路径。

因此，做完单细胞测序后还要做PCF，本质上是为了完成从“细胞发现”到“组织原位观察”的转换。单细胞测序负责找出潜在重要细胞群、转录状态和候选marker，PCF则进一步回答这些细胞是否在组织中真实形成空间分布差异，是否呈现特定蛋白状态，以及是否与其他细胞构成可分析的邻域关系。对于肿瘤免疫、炎症、纤维化和神经退行性疾病等组织微环境课题，PCF可以帮助研究者把单细胞图谱放回组织结构中理解，为后续机制假设和转化研究提供更具体的组织层线索。

【说明】本文仅为科研技术方法介绍，不涉及疾病诊断、治疗建议、疗效预测、用药指导或临床决策。文中提及研究发现均来自学术文献，相关分析结果需结合更多实验和研究进一步观察与复核，不构成任何医疗意见。

【参考文献】

Ruf et al., Tumor-associated macrophages trigger MAIT cell dysfunction at the HCC invasive margin, Cell, 2023.