酵母双杂交——核体系

酵母双杂交技术背景

酵母双杂交技术分为酵母核体系双杂交和酵母膜体系双杂交，二者均作为研究蛋白-蛋白互作的工具，具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点，现广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的验证。

酵母核体系双杂交原理

其原理是：Gal4转录因子由DNA结合域（binding domain，BD）和转录激活域（active domain，AD）组成，二者可以分开独立表达为有功能的蛋白。

当二者在物理空间上靠近时可以表现出完整的转录因子活性，基于此，把目的蛋白分别与BD、AD融合表达，当目的蛋白发生互作时，使得BD、AD在物理空间可以靠近，这时就能够表现出完整的转录因子功能，从而激活下游基因的表达。

酵母双杂交应用

1. 检测一对已知蛋白的相互作用
2. 用已知功能的蛋白基因筛选cDNA文库，寻找与其互作的结合蛋白，进而解析其互作网络

酵母双杂交优缺点

优点：

1. 采用高拷贝和强启动子的表达载体使目的蛋白过量表达，方便复合物形成;
2. 筛选过程在真核酵母活细胞内进行，一定程度上反映了体内的真实情况;
3. 文库来源广泛，可采用不同组织、器官、细胞类型和特殊分化时期材料构建成cDNA文库

缺点：

1. 目前的酵母双杂交方法存在操作复杂，假阳性和假阴性多，结果主要为定性数据；
2. 结果主要为定性数据，不易精确判断蛋白质相互作用的强度等问题；
3. 酵母双杂交结果需要再用其他方法进行进一步确认

核体系双杂交载体系统

核体系双杂交载体系统为pGBKT7+pGADT7。

核体系双杂交筛库中pGBKT7作为酵母双杂交bait表达载体，能够表达Gal4 DNA结合结构域（DNA-BD）与bait蛋白质的融合蛋白。pGADT7作为酵母双杂交Prey表达载体，能够表达Gal4激活结构域（AD）与目的蛋白质的融合蛋白。

✅ pGBKT7载体主要元件

1. Kan（大肠杆菌筛选标签）
2. TRP1（酵母营养缺陷筛选标签）
3. ADH1（组成型启动子）
4. Gal4-BD（Gal4的DNA结合结构域）

pGBKT7载体图谱

✅ pGADT7载体主要元件

1. Amp（大肠杆菌筛选标签）
2. LEU2（酵母营养缺陷筛选标签）
3. ADH1（组成型启动子）
4. Gal4-AD（Gal4的激活结构域）

pGADT7载体图谱

酵母双杂交筛库流程（以核体系为例）

核体系双杂交筛库案例展示

1、载体构建

将目的基因A构建到pGBKT7载体上，形成诱饵克隆pGBKT7-A重组质粒。

2、自激活检测

将pGBKT7-A+pGADT7质粒共转AH109，从长出的酵母转化子随机随机挑取3个克隆，点在SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA、SD-TLHA+X-α-gal平板上，30℃培养3-5天。

图1 自激活检测结果

注：（+）为阳性对照pGBKT7-p53+pGADT7-largeT

（-）为阴性对照pGBKT7-laminC+pGADT7-largeT

另：若诱饵基因有自激活活性，可加3-AT抑制，3-AT是酵母HIS3蛋白合成的竞争性抑制剂，用于抑制HIS3基因的泄漏表达。通过梯度加3-AT，观察在哪种浓度条件下自激活可被抑制，后续背景筛选条件就为加有对应浓度3-AT的三缺培养基。

3、文库筛选

用含有正确pGBKT7-A诱饵质粒的AH109酵母菌株作为受体菌制备感受态，将文库质粒转入其中，涂SD-TLH筛选平板。30℃恒温培养3-7 d，观察菌落生长。

图2 筛库结果

注：（+）为阳性对照pGBKT7-p53+pGADT7-largeT；

筛库结果：筛库的SD-TLH平板上长了96个单克隆菌落。

1. 阳性克隆鉴定

为了鉴定SD-TLH平板中筛选到的96个阳性克隆分别是什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，并数据库中的序列进行BLAST比对分析。

5、酵母阳性克隆回转验证

将上述划线于SD-TLH缺陷型平板上长出的阳性克隆转化子分别用无菌水重悬后，调整OD600=0.2点至SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+X-α-gal、SD-TLHA和SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板，30℃恒温培养3-4天。

结果表明筛选得到的28个酵母阳性克隆均能在SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+X-α-gal、SD-TLHA和SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板上生长，并能在SD-TLH+X-α-gal、SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板上显蓝色。

图3 回转验证结果

注：（+）为阳性对照pGBKT7-p53+pGADT7-largeT

（-）为阴性对照pGBKT7-laminC+pGADT7-largeT

蓝色表格标注为该条件下可以生长的克隆，白色表格标注为该条件下未生长的克隆

核体系双杂一对一验证

1、自激活验证

验证目的基因有无自激活现象，方法同筛库一样。

2、互作验证

将实验组pGBKT7-A+pGADT7-B，对照组pGBKT7+pGADT7-B和pGBKT7-A+pGADT7，阳性对照pGBKT7-p53+pGADT7-largeT，阴性对照pGBKT7-laminC+pGADT7-largeT已PCR验证的克隆分别用2 ml无菌ddH2O重悬，调整OD600至0.2，浓度设置为三个梯度100、10-1、10-2，吸取10 ul做点板实验，分别点于SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+X-α-gal、SD-TLHA、SD-TLHA+X-α-gal的缺陷平板中，30℃恒温培养3-5天。

图4 互作检测结果

注：（+）为阳性对照 pGBKT7-p53+pGADT7-largeT

（-）为阴性对照 pGBKT7-laminC+pGADT7-largeT