简言之

解析蛋白在细胞内的空间排布需要联合成像与互作数据，但规模化获取２类数据技术门槛极高。本文建立HIT-MAP标准化分析流程，利用同一基因编辑细胞系同步获取免疫荧光、互作质谱２类多组数据，大幅降低亚细胞图谱构建门槛。

tideker@health.ucsd.edu

chavez2@health.ucsd.edu

#免疫荧光 #亲和纯化质谱 #多模态整合 #亚细胞定位 #蛋白互作网络 #剪接体 #CRISPR敲入 #宽场显微镜 #反卷积成像 #内源蛋白标记

亮点

• HIT-MAP将内源蛋白标签、免疫荧光成像、亲和纯化质谱（AP-MS）技术一体化整合

• 9×FLAG标签相比3×FLAG，对内源表达蛋白的检测灵敏度显著提升

• 反卷积宽场显微镜成像可得到接近共聚焦的蛋白定位图像

• 多模态数据联合分析筛选出CCDC12作为剪接体Bact复合物新组分

摘要

免疫荧光成像、AP-MS是解析亚细胞蛋白排布核心手段，但现有方案成本高、难以规模化，且大多只能单独采集成像或互作数据，无法统一分析。本文开发高通量整合细胞图谱标签流程（HIT-MAP），基于CRISPR内源表位标记技术，搭配标准化宽场荧光成像与优化互作质谱方案，可在同一克隆细胞系同步采集２类模态数据。以HEK293T细胞16种代表性蛋白为模型完成验证：HIT-MAP共鉴定出576组高置信蛋白互作，复现经典蛋白复合物，并区分多模态联合聚类的蛋白亚群。多组学整合分析证实CCDC12是未被充分研究的人源剪接体Bact复合物组分，该结论得到亲和纯化质谱、无标签尺寸排阻色谱质谱、扰动转录组３重证据支撑。HIT-MAP大幅降低多模态亚细胞图谱的技术与经济门槛。

结果

HIT-MAP整体流程与表位标签筛选基准

图1 HIT-MAP多组学数据采集完整流程示意

(a) 3步核心流程：

步骤1：基于CRISPR高通量内源FLAG敲入，构建稳定FLAG标记细胞系；

步骤2：同一标记细胞系同步开展免疫荧光成像、FLAG亲和纯化质谱；免疫荧光捕捉蛋白亚细胞定位，AP-MS捕捉蛋白生物互作；

步骤3：多模态数据整合构建全局蛋白图谱，挖掘未知功能蛋白复合物。

(b) 分步实验管线：内源FLAG克隆细胞系分为2条平行实验分支；荧光分支经Z轴堆叠成像、理查森-露西反卷积去除失焦杂光，得到等效共聚焦定位图；质谱分支采用抗FLAG磁珠富集互作蛋白，打分构建高置信互作网络。

反卷积宽场成像可等效共聚焦定位精度

图2 免疫荧光成像体系基准验证

(A) 宽场图像处理流程：采集31层Z堆叠原始图像，经点扩散函数反卷积、深度学习嵌入得到1024维蛋白定位特征向量；

(B) 3×FLAG、9×FLAG标记蛋白成像特征与人类蛋白图谱（HPA）参考图相似度对比，配对t检验p=0.09；

(C) 原始宽场图像、反卷积宽场图像分别与HPA图谱相似度小提琴图，p=0.0007；

(D) 16种靶蛋白9×FLAG反卷积荧光代表图，黄色 =核蛋白、红色 =线粒体蛋白、蓝色 =胞质蛋白；

(E) 全部蛋白荧光特征分层聚类热图，顶部色条标注HPA亚细胞分区；

(F) 同一亚细胞/跨亚细胞蛋白特征余弦相似度小提琴图，曼-惠特尼U检验p=9.8×10⁻¹⁷。

内源AP-MS捕获高置信蛋白互作网络

图3 HIT-MAP稳定捕获内源蛋白互作网络

(A) AP-MS数据处理管线：DDA质谱采集→互作打分筛选高置信蛋白互作→Node2Vec网络嵌入；

(B) 3×FLAG、9×FLAG数据分别基于CORUM、STRING、hu.MAP数据库的ROC曲线（AUROC对比）；

(C) 各诱饵蛋白鉴定已知/新互作数量柱状图，粉色 =数据库已有互作、灰色 =全新互作；

(D) 本研究与传统AP-MS方案对CORUM复合物富集比值箱线图，无统计学差异；

(E) 9×FLAG数据集全局蛋白互作网络，色块标注CORUM经典复合物：剪接体、核糖体、SMN复合物、NuA4乙酰转移酶复合物等。

多模态联合聚类挖掘蛋白功能社群

图4 成像+质谱双模态整合嵌入与功能验证

(A) 多模态整合UMAP降维图，聚类分为核糖体、剪接体E/C复合物、染色质调控、线粒体5大蛋白集群；

(B) 3类特征（荧光嵌入、互作网络嵌入、联合多模态嵌入）两两相关性热图；

(C) 3类模态下高相似蛋白对的STRING通路距离分布密度图；

(D) CCDC12蛋白尺寸排阻色谱共洗脱热图，显示其与剪接体Bact组分共流出；

(E) CCDC12敲低转录扰动特征与各类剪接体复合物相似度小提琴图，全部分组对比p均< 0.01。

讨论

HIT-MAP相较传统方案核心优势

图5 传统方案与HIT-MAP资源、成本对比

(A/B) 传统成像/质谱流程vs HIT-MAP资源需求对比：传统需单一样本处理、蛋白特异性抗体、高端设备；HIT-MAP批量操作、通用抗体、常规显微镜；传统依赖cDNA过表达，HIT-MAP维持内源生理表达；

(C/D) 不同靶标数量下，2类方案成像、质谱总成本柱状图，灰色= 传统方法，绿色= HIT-MAP。

数据和代码

本研究质谱蛋白质组原始数据已存入ProteomeXchange联盟旗下PRIDE数据库

数据集编号PXD067895

16种试点蛋白对应的3×FLAG、9×FLAG标记细胞系共聚焦图像、原始宽场图像、反卷积处理后图像全部上传至BioImage Archive

归档编号S-BIAD2261

论文全部原始代码归档于Zenodo平台

https://doi.org/10.5281/zenodo.20548576

开发版本持续维护于GitHub仓库

https://github.com/idekerlab/hit_map

详细总结

思维导图

研究背景与现有技术痛点

IF成像相似度

和HPA人类蛋白图谱参考比对

宽场成像反卷积效果验证

HIT-MAP成本与规模化优势对比

参考

Cell Rep Methods. 2026 Jul 22:101534. doi: 10.1016/j.crmeth.2026.101534.

HIT-MAP: A scalable approach to multimodal mapping of subcellular organization

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