摘要

新生儿出生后，肠道菌群的定植对新生儿的健康发育起着至关重要的作用，并影响其日后的健康和疾病。了解新生儿肠道菌群的发育以及其与新生儿宿主的相互作用是一个重要的研究领域。然而，该领域的研究必须解决影响研究方法设计和实施的一系列具体挑战。如果不加以考虑，那么这些问题可能会给研究带来偏倚，从而对研究结果的相关性、可重复性和效应产生负面影响。本文概述了这些挑战的性质，并提供了当前和未来的解决方案，以帮助研究人员更好地进行研究设计。

前言

人类肠道寄居着大量的微生物，包括细菌、真菌、病毒和古菌，形成了一个高度复杂和多样化的群落。这种微生物组已被证明在宿主内部的许多生理过程中发挥着重要作用，包括但不限于：免疫系统的发育和调节、神经信号传导的改变、维生素和氨基酸的生物合成、食物消化以及抑制病原体的生长。因此，肠道菌群对于人类健康的发展和维持至关重要。肠道菌群的异常发展会对宿主的健康产生负面影响。肠道菌群的紊乱与胃肠道、神经系统、代谢、肝脏、自身免疫、心血管和肿瘤等疾病有关。这种在健康和疾病方面的重大影响对新生儿来说尤其如此，因为在新生儿中，微生物群落、宿主免疫系统和屏障防御机制都在发展。肠道微生物定植通常从出生时开始，婴儿从子宫出来时就接触到活性微生物。在出生后一年内，肠道菌群对于训练婴儿的免疫系统和促进长期健康的生理发育至关重要。生命早期肠道菌群的异常发展与出生后不久出现严重的病理状况有关，如坏死性小肠结肠炎(NEC)，这是早产儿死亡的主要原因之一。

因此，了解新生儿肠道微生物群的发育及其与宿主的相互作用机制，对于维持和改善人类的健康状况至关重要，这种健康结果可以持续到儿童期甚至更长时间。重要的是，该领域的研究必须解决一系列挑战，这些挑战可大致分为三个方面：

①设计和招募具有代表性的研究队列；

②准确检测肠道微生物组的组成；

③研究新生儿宿主与肠道微生物组之间的相互作用。

设计和招募代表性研究队列

尽管新生儿肠道菌群的多样性不如成人，但其仍然是一个部分受遗传和环境因素影响的复杂系统，并且具有不同的特性，这些特性在婴儿之间存在差异。因此，研究结果会受到各种协变量和混杂因素的影响。这些因素包括早产、饮食、生活在有毛茸茸宠物的家庭中、使用益生菌、抗生素治疗、居住在农村或城市、特定等位基因频率、种族和父母社会经济地位等等。在分析研究数据时，还必须考虑到产妇健康因素，因为抗生素的使用、母亲的体重指数、膳食摄入和妊娠期糖尿病的发生都已被证明会对新生儿微生物组的发育产生影响。因此，必须仔细设计研究队列，以反映感兴趣人群中协变量的平衡，并尽可能排除混淆因素。

i）队列设计

队列规模在这方面是一个重要的因素，对于确定试验的统计功效尤其关键。鉴于分析微生物组数据集的方法众多(如alpha多样性、beta多样性、相对丰度)，执行功效计算并非易事，而且可能存在一定的主观性。变量的效应量越小，检测相关信号和克服混淆因素的掩蔽所需的样本量就越大。当研究宿主基因对微生物组的影响时尤其如此。直接测序候选基因组以确定感兴趣的等位基因将需要数百名新生儿的数据，而全基因组关联研究(GWAS)通常需要数千人的队列。然而，在解决以新生儿微生物组表型和相关病理为重点的研究问题时，招募足够多的样本量可能具有挑战性。早产儿NEC的研究就是一个关键例子。只有10%的婴儿是早产儿，其中大约5-10%患有NEC。这使得可用于研究的患者数量有限。

当患者数量有限时，跨整个国家或国际开展多中心研究可以最大化样本量。从多个地理位置招募也可能增加队列的人口统计学多样性，使其更具有代表性和普适性。除了观察性研究之外，将微生物组研究嵌入随机对照试验(RCT)中可以探索潜在的机制。在英国进行的早产儿肠道影响机制(MAGPIE)研究就是一个例子，该研究招募了来自12家NHS医院的479名早产儿。当然，大型队列和多中心研究会使样本收集的后续工作变得复杂，需要将样本存储并运输到中心站点进行分析。此外，更大和更多样化的队列可能会引入额外的混淆因素，而这些混淆因素可能在使用较小和更均质的队列时是不存在的。需要注意的是，无论队列的大小或地理分布如何，任何研究结果都仅限于在研究中调查的当地、国家或洲际人口。特别是考虑到工业化和非工业化国家之间的差异时，影响肠道菌群的大量协变量和混淆因素使结果难以推广到所有新生儿。如果这些关联背后的生物学机制得到充分研究，那么由于所有人类在生物学上具有基本的相似性，就有可能超越狭窄群体范围进行更广泛的推断。

ii）控制混淆因素的其他方法

除了优化队列大小和地理分布外，还有一些方法可以解决微生物组研究中容易受到混淆因素影响的问题。通过基于一组特征对队列进行限制，以减少这些特征导致的混杂效应。例如，可以将研究限制在仅包括妊娠37周后出生的新生儿，从而消除早产儿与足月儿这一混淆因素对微生物组的影响。如果是研究某一特定表型或病理学特征，则可以采用匹配方法，根据潜在混淆因素将表型/病理阳性和阴性组进行成对匹配。例如，在NEC研究中就使用了这种方法，将NEC和非NEC新生儿的各种特征(包括胎龄、出生体重以及是否接受益生菌等)进行匹配。限制和匹配方法，以及样本量和地理位置，都构成了初始队列设计的一部分。此外，在收集完数据之后，还有一些分析方法可以防止混淆因素带来的影响，如分层分析和多变量分析方法。

分层分析是将研究队列根据潜在混淆因素(例如年龄或性别)划分为不同层次的过程。然后可以观察到特定层次内的关联性，这些关联性与整个队列的关联性不同，从而确认某个变量是否是混淆因素。但对于具有大量元数据类别的队列来说，分层可能会过于复杂和耗时，因为每增加一个变量，需要分析的层数就会迅速增加。多变量分析方法更适用于这类数据集。通过使用一个综合的数学过程，研究感兴趣的变量并调整潜在的混淆变量。此外，分层可以揭示与特定子层次相关的效应，这些效应在多变量分析和调整中可能被忽略。分层分析的另一个优势是可以更容易地在子层次中识别交互效应。例如，根据婴儿是否母乳喂养对数据进行分层，可以更清晰地观察母乳喂养与其他变量之间的交互作用效应，以及它们对肠道微生物组成的影响。

准确检测肠道微生物组的组成

准确分析肠道菌群与协变量的关联，取决于对微生物组成的准确检测。整个研究都以这个过程的稳健性和精确性为前提。但已有研究表明，实验设计和方法选择可能会影响粪便菌群组成并使下游分析产生偏差。样本制备的各个阶段都是如此，包括样本收集、样本储存、DNA提取和测序方法。在讨论对基于培养方法的影响之前，本节将首先重点关注基于分子的方法，即16S rRNA基因测序和宏基因组学。对测序方法的详细讨论超出了本综述的范围，但研究人员在设计研究时应考虑该技术的最新发展。例如，较长的读取长度可以改进基因组组装和结构变异的检测，而测量绝对丰度可以更准确地反映真实微生物变化的情况。

图1总结了在这些阶段尽量减少引入偏差的方法。

i）样本收集

个体肠道菌群的组成会随时间波动，这意味着在某一天收集的样本不能被视为其微生物群落的确切代表。研究必须使用纵向采样来检测、分析和说明这种变异。因此，样本收集的时间是任何微生物组研究中的关键因素。这将影响到研究内部以及已经发表的数据集之间的比较。研究新生儿对这一过程提出了挑战，因为无法精确控制新生儿排便的时间，他们无法表达自己的意愿，也无法自己收集样本。这个过程还受到新生儿是在医院还是在家的影响。在医院内，病房工作人员会系统地收集样本，但是粪便仍然会暴露在尿布内的环境温度和氧气中，通常暴露的时间不确定。这是一个问题，因为暴露于环境温度已被证明会影响婴儿粪便样本中不同细菌属的生长或抑制。相比之下，如果新生儿在家中，父母可能很快就知道新生儿是否排便，然后可以要求父母在收集样本之前估计样本在尿布里的存在时间，从而测量样本暴露于环境温度中的时间。

ii）样本储存

在样本收集之后，需要对其进行处理和分析，如果无法立即进行分析，则应将其储存起来。样本的正确储存对于稳定粪便微生物组至关重要，因为有研究表明，如果将其放置在室温下48小时，粪便微生物组会发生显著变化。这种变化是由于细菌种类的差异性生长和死亡，以及细菌DNA在这种温度和氧条件下的降解所导致的。如果样本在这种条件下保存，将无法准确测量采样时的体内肠道菌群，并且会使后续分析产生偏差。因此，样本储存对于任何新生儿微生物组研究都是一个关键问题。这对于多中心研究或依赖于在家收集患者样本的研究尤其如此。对于这类研究，样本可能需要运送到研究机构进行分析，这延长了处理开始前的时间，如果不考虑适当的采集和存储条件，那么就会增加微生物群发生变化的可能性。

已有多项研究对不同储存方法保存粪便菌群的能力进行了评估。最近对92项研究进行的系统回顾发现，在这些研究中有71.4%采用了-80℃冷冻的方法，这是最常用的方法。经证实，在此温度下保存新生儿粪便样本可在很大程度上保留微生物菌群至少2年。此外，由于样本的快速冷冻和通过冷链运输并非总是可行的，因此也对各种储存缓冲液进行了测试。其中评估最广泛的是商用OMNIgene.Gut Stool Microbiome Kit (DNA Genotek)。Choo等人发现，经过72小时的储存后，与冷冻-80℃的对照组相比，微生物群组成或多样性无明显差异。相比之下，存储在RNAlater和Tris-EDTA中的样本显示出大量的菌群转移。

Panek等人发现OMNIgene.Gut试剂盒中的样本在室温下保存14天的效果优于冷冻。他们还指出，与冷冻相比，这种缓冲液可以更好地保存变形菌门，但可能会人为地增加萨特氏菌属的存在。另一种保存试剂盒，即粪便核酸收集和保存管(Norgen BioTek Corp)，也可以根据细菌细胞壁结构改变特定属的表征。这些工作主要是为了考察样本储存如何影响分子分析，特别是16S rRNA基因测序和宏基因组测序，从而最终反映出对细菌DNA的保存情况。同时，考虑样本直接培养和分离细菌的情况也很重要。从粪便中培养活微生物可以确定分子方法可能遗漏的细菌。此外，分离微生物还可用于进一步的实验工作，包括研究特定菌株的代谢能力或微生物-宿主相互作用。最好的做法是将粪便样本等量分装在多种低温保存培养基中，以保证分离菌株的分类范围尽可能广泛。

iii）细菌DNA的提取和纯化

在提取DNA之前，粪便样本必须完全均质化。研究表明，对粪便进行分采样可获得高度可变的微生物菌群数据，这是由于不同菌群被包裹在不同的微环境中。因此，均质化有助于减少样本内变异。目前有许多商业化试剂盒都经过优化，可用于从各种样本类型(包括粪便)中提取DNA。Westaway等人(2021)对92项早产儿肠道微生物组的系统性回顾反映了这一点，他们发现提取方法(共有15种不同的方法)的选择存在很大差异。其中，使用最多的是Qiagen QIAmp DNA粪便试剂盒(占40.3%的研究)，其次是非商业试剂盒(14.9%)和Qiagen PowerLyzer PowerSoil试剂盒(10.4%)。DNA提取方法的选择是微生物组分析中的一个重要偏倚来源，主要取决于所使用的均质化和裂解方法。细菌的细胞壁结构在这里是一个关键因素，因为革兰氏阳性细胞具有更厚的肽聚糖层，因此可能需要比革兰氏阴性细胞更长的裂解时间或更强的裂解力。因此，由于裂解不彻底导致细胞壁保持完整，或者由于过度强烈的裂解使容易溶解的细胞的DNA降解，那么整个属可能会在下游分析中被遗漏。

上述偏倚可以通过方法标准化来解决。使用国际标准化的微生物组分析方案(包括样本收集和储存、DNA提取、测序和生物信息学流程)将减少这些阶段的混淆因素，并使结果更加一致。然而，这样的方案可能不能满足特定研究团队的特定需求。另一种方法是开发一套参考试剂作为国际标准，以验证其他方法。生物信息学方法也可以根据特定方法引入的变异性对数据进行归一化。

研究新生儿宿主与肠道菌群之间的相互作用

对新生儿肠道菌群及其随时间发展的描述可以为研究人员提供假设，并有助于其后续工作。这些工作包括了解新生儿肠道上皮(即宿主)如何响应和适应细菌的定植。虽然已知宿主-微生物群的相互作用是新生儿健康生理和某些病理发展的基础，但这些过程的详细机制在很大程度上仍是未知的。解决这些问题的尝试也因所面临的伦理考虑而变得困难。

缺乏可用于研究的新生儿肠道组织是研究人员面临的一个重大阻碍。在成年人中，通过使用内窥镜活检获取组织进行研究来调查与肠道相关的病理(如肠易激综合征)。然而，这种方法并不适用于新生儿群体，因此研究人员只能依赖于从手术拯救中切除的新生儿组织(即不是为了研究目的收集，而是使用原本会被丢弃的切除组织)。这种重大手术通常是在患有严重疾病的婴儿身上进行的，这意味着收集的组织通常是不健康的。这使得研究早产儿和足月儿正常肠道组织的发育和功能变得更具挑战性，同时也使得难以设计适当的对照条件进行离体实验。

i）动物模型

使用与人类肠道解剖结构相似的动物模型是这个问题的一个解决方案。目前已经建立了小鼠、大鼠和猪的早产儿和足月儿肠道模型。使用无菌小鼠、大鼠和猪进行的微生物组研究为我们提供了重要见解，揭示了肠道菌群与免疫成熟、健康的肠道上皮形态、骨骼肌生长以及疾病病理之间的关联。然而，这些模型在许多方面仍然存在限制，比如动物护理成本高、缺乏在人类群体中观察到的遗传变异、无法完全再现塑造人类肠道微生物组的复杂环境因素，尽管存在相似之处，但解剖和生理方面的差异阻碍了人类系统的真正重建。它们作为早产儿肠道模型也有一定的局限性，因为早产小鼠、大鼠和猪大约在妊娠期的90-95％出生，而人类早产儿可能在妊娠期的60％出生。因此，早产动物可能无法准确地模拟早产人类的免疫系统和解剖结构的不成熟。该模型研究的另一个缺点是这些动物具有不同于人类的内源性肠道微生物组。虽然建立了人源化动物肠道菌群的方法，但目前尚不清楚特定的人类菌群在这些动物肠道中的定植情况，并且移植的微生物群是否能够发挥相同的功能。

ii）离体模型

另一种方法是使用离体上皮细胞模型，例如Caco-2细胞和肠源性器官样体(enteroids)。Caco-2细胞最初来源于人类结肠癌，可以作为一个极化的单层细胞生长，细胞之间形成紧密连接。因此，Caco-2细胞一直是体外培养肠上皮细胞的主要细胞系。然而，该细胞系在很多方面存在局限。首先，Caco-2单层只有一种细胞类型，而肠道上皮包括多种类型的细胞，包括肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞、干细胞和内分泌细胞。因此，它们无法重现肠道上皮的组织结构。其次，这些细胞源自癌细胞，因此其生理特性可能与正常健康的上皮细胞不同。最后，这种细胞系不是患者特异性的，即不是原代细胞系。

在过去的十年中，随着在肠隐窝中发现Lgr5阳性干细胞，类器官模型得以发展。从肠道组织中提取隐窝，将干细胞培养成新的肠道上皮细胞，如图2(a)所示。类器官自然形成极化的三维球状结构，包含所有主要细胞类型，并且是具有生理活性的组织。从肠隐窝中提取的类器官可用于研究组织稳态、疾病病理和开发个性化的医学方法。它们保留了宿主的遗传易感性和免疫特征，因此非常适用于探究宿主与肠道微生物群之间相互作用的实验。

图2.(a)类器官培养程序概述。(b)单层类器官模型示意图。

肠道类器官培养的备选细胞来源包括诱导性多能干细胞(iPSCs)、胚胎干细胞(ESCs)以及流产胎儿的肠道碎片。这些细胞系的一个优点是它们不依赖于新生儿手术，因此也不局限于典型的非健康组织。此外，iPSCs和ESCs的分化模拟了胚胎生长，因此为研究肠道发育提供了更好的模型。但要注意的是，这些细胞衍生的类器官和胎儿衍生的类器官与患者及其独特表型(例如肠道菌群组成和对疾病的遗传易感性)缺乏联系。

目前已开发出多种模型系统可用于利用类器官细胞系进行宿主-微生物研究，这些系统通常涉及将细菌显微注入到3D类器官的腔内、逆转3D类器官的极性，或者从类器官制作2D单层。显微注射可保持类器官的3D结构，并允许系统内细菌的生理相关空间定位(见图2(a))。逆转3D类器官的极性包括将类器官由内而外翻转，即基底外侧表面位于腔内，而顶侧表面位于腔外。这种方法避免了繁琐且技术上具有挑战性的显微注射，因为只需将肠道微生物和营养物质添加到周围的培养基中即可。

类器官单层是通过解离球状类器官并将细胞播种在表面上制备的，最常用的是Transwell可渗透支架，如图2(b)所示。细胞之间的紧密连接重新形成极化的2D单层上皮。这种方法的主要优点是Transwell系统允许基底外侧腔室与顶腔室隔离。然后可以使顶腔室无氧，而基底侧则保持含氧，这意味着可以建立跨肠道上皮的自然氧梯度。该方法已得到进一步发展，允许将氧气持续灌注到基底外侧腔室，从而延长类器官培养的时间。然而，由于其是2D结构，这意味着单层培养牺牲了肠道的3D组织结构。类器官单层也可以植入微流体系统，以创建一个“肠道芯片”模型。这种系统提供的流体控制允许营养物质、代谢物或微生物在严格的时空控制下连续灌注到单层上皮。这些系统可以重现上皮细胞在肠腔内通常受到的流体流动和剪切应力。此外，与3D类器官培养方法一样，微流体系统缺乏肠道上皮细胞的生理氧梯度。

虽然类器官模型有各种优点，但也存在一定的局限性。它们缺乏宿主微环境的组成部分，如免疫细胞、神经元和肠道血管系统。尽管存在正确的细胞类型，但类器官无法形成真正的绒毛-隐窝结构，这意味着无法重建肠道的3D隔室。此外，类器官培养依赖于诸如Matrigel之类的基质和生长因子，这些生长因子的定义不明确，不同批次的生长因子不同，且价格昂贵。此外，类器官培养技术复杂且通量相对较低。

尽管如此，在重建宿主组织的功能复杂性方面，类器官仍然比单细胞类型的体外培养更有优势。目前已经开发了在类器官培养中引入其他细胞类型(如免疫细胞)的共培养系统，以增加这些模型组织的复杂性和生物学相关性。与动物模型相比，在细菌共培养系统内使用类器官也提供了更大的灵活性，可用于研究新生儿肠道菌群的不同菌株如何与肠上皮相互作用。这些实验可以阐明新生儿肠道微生物群中单个菌株的机制作用。胶原蛋白支架也被开发用于在类器官内形成真正的绒毛-隐窝结构。最后，类器官确实在一定程度上解决了新生儿组织供应不足的问题，因为培养干细胞本质上就是生长更多的组织。这使得可以从单块肠道组织进行多轮实验，并通过在不同研究团体之间共享已建立的类器官细胞系，使研究成果具有可重复性。

结论

肠道菌群在新生儿生长发育中起着重要作用，影响其生命早期和成年期的健康结局。新生儿研究面临独特的方法学挑战，计划开展这一领域工作的研究人员必须了解样本采集、储存和处理对结果的影响。研究设计应确保队列足够大，包括任何重要的协变量，并克服潜在的混淆因素，同时能够代表更广泛的感兴趣人群。纳入随机对照试验的人类实验研究可以将肠道菌群的变化与干预效果联系起来，从而进一步阐明潜在的机制。实验方法必须谨慎选择，并尽可能标准化，以减少在检测微生物组成分时引入的偏倚。新生儿肠道代表性模型也应得到优化，并用于探索微生物群对新生儿宿主影响的生物学机制。最终，研究小组应该确保在力所能及的情况下共享克服这些挑战的最佳实践，以提高该领域的研究质量。

参考文献：Jonathan A Chapman & Christopher J Stewart (2023) Methodological challenges in neonatal microbiome research, Gut Microbes, 15:1, 2183687, DOI: 10.1080/19490976.2023.2183687

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