摘要：为避免甘蓝稳定转化中的“脱靶”与“无效编辑”风险，原生质体瞬时验证成为必由之路。本文聚焦BoPDS基因案例，详解如何利用PEG转化在48 h内完成gRNA切割效率评估，涵盖载体构建、转染及突变检测全流程。

一、 为何要先做原生质体验证？

甘蓝CRISPR稳定转化周期长（≥4个月），若直接进行稳定转化，可能因gRNA设计不佳导致编辑失败。原生质体瞬时体系可在2-3天内获得编辑数据，大幅降低研发风险与时间成本。

二、 验证流程（以BoPDS基因为例）

1. 载体构建与质粒准备

• 靶点设计：针对目标基因（如BoPDS）设计2条gRNA（GC含量40%-50%），避免脱靶。

• 载体选择：使用pBSE401或类似CRISPR二元载体。

• 质粒提取：需高纯度质粒（无内毒素），建议使用伯远生物的质粒提取服务，确保转染兼容性。

2. 原生质体转化与培养

• 材料：4 d苗龄下胚轴原生质体（产量高）。

• 转染参数：20 µg质粒DNA，20% PEG4000（含0.3 mol/L CaCl₂），室温15 min。

• 培养：转染后于WI培养基中黑暗培养24-48 h（编辑峰值通常在48 h）。

3. 编辑效率检测（T7EI法）

• DNA提取：收集原生质体，提取基因组DNA。

• PCR扩增：使用跨越靶位点的引物进行扩增。

• 酶切与测序：T7EI酶切后电泳分析；或进行TA克隆测序（推荐测序20-30个单克隆），计算 indel 频率。

4. 结果判读

• 有效gRNA：测序显示靶点附近有碱基缺失/插入（如BoPDS靶点1的T→G替换）。

• 无效gRNA：无突变或效率<5%，需重新设计。

三、 关键注意事项

• 阳性对照：务必设置GFP空载体对照，以确认转染效率（应>40%）。

• 阴性对照：设置未转化原生质体DNA，排除背景干扰。

• 载体质控：构建好的CRISPR载体建议送伯远生物进行测序验证，确保gRNA序列无误。

四、 技术优势与局限

• 优势：快速（<1周）、高效（编辑效率可达20%-30%）、无需考虑基因型限制。

• 局限：仅验证切割活性，无法评估表型；需后续稳定转化验证遗传稳定性。

结论：利用甘蓝下胚轴原生质体进行CRISPR载体预验证，是优化编辑体系的关键步骤。通过规范的PEG转染和T7EI/测序分析，可显著提高后续稳定转化的成功率