完成了前面的基础质控、过滤以及去除细胞周期的影响后，我们可以开始SCTransform normalization。

SCTransform normalization的优势：

• 1️⃣ 一个SCTransform函数即可替代NormalizeData, ScaleData, FindVariableFeatures三个函数;
• 2️⃣ 对测序深度的校正效果要好于log标准化(10万以内的细胞都建议使用SCT);
• 3️⃣ SCTransform,可用于矫正线粒体、细胞周期等因素的影响，但不能用于批次矫正;
• 4️⃣ 改善信/噪比；
• 5️⃣ 发现稀有细胞。

用到的包

rm(list = ls())
library(Seurat)
library(tidyverse)
library(SingleR)
library(celldex)
library(RColorBrewer)
library(SingleCellExperiment)
library(ggsci)

示例数据

这里我们还是使用之前建好的srat文件，我之前保存成了.Rdata，这里就直接加载了。

load("./srat1.Rdata")
srat

计算细胞周期评分

4.1 新版基因集

这次我们用新版的细胞周期基因集。

cc.genes.updated.2019

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4.2 计算评分

s.genes <- cc.genes.updated.2019$s.genes
g2m.genes <- cc.genes.updated.2019$g2m.genes

srat <- CellCycleScoring(srat, s.features = s.genes, g2m.features = g2m.genes)
table(srat[[]]$Phase)

SCTransform normalization

这里我们用一个函数就可以完成。

srat <- SCTransform(srat, 
                    method = "glmGamPoi", 
                    ncells = 8824, 
                    vars.to.regress = c("percent.mt","S.Score","G2M.Score"), 
                    verbose = T)
srat

降维与聚类

我们这里进行一下的标准降维、聚类，这里的dims推荐大家尽可能设置的大一些。

srat <- RunPCA(srat, verbose = F)
srat <- RunUMAP(srat, dims = 1:30, verbose = F)
srat <- FindNeighbors(srat, dims = 1:30, verbose = F)
srat <- FindClusters(srat, verbose = F)
table(srat[[]]$seurat_clusters)

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可视化一下吧。

ncluster <- length(unique(srat[[]]$seurat_clusters))

mycol <- colorRampPalette(brewer.pal(8, "Set2"))(ncluster)

DimPlot(srat, label = T,
        cols = mycol)

稀有细胞marker探索

接着我们探索一下血小板和树突状细胞的marker，分别为PPBP和LILRA4。

7.1 可视化

这里我们可以发现在PPBP在一个极小的细胞群中没有被标注出来。

FeaturePlot(srat,c("PPBP","LILRA4"),
            label = T,
            cols = colorRampPalette(brewer.pal(11, "Spectral"))(10)
            )

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7.2 解决方案

我们可以通过提高FindClusters函数中的resolution选项来提高聚类数量。
当然最简答的办法就是手动标记啦，这里就不演示啦。

srat <- FindNeighbors(srat, dims = 1:30, k.param = 15, verbose = F)

## Leiden algorithm即algorithm = 4， 需要配置python环境
srat <- FindClusters(srat, verbose = F, algorithm = 4, resolution = 0.95)

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看一下现在有多少个聚类吧。

table(srat[[]]$seurat_clusters)

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可视化一下吧！~

ncluster <- length(unique(srat[[]]$seurat_clusters))

mycol <- colorRampPalette(brewer.pal(8, "Set2"))(ncluster)

DimPlot(srat, label = T,
        cols = mycol)